两种野生大麦（Hordeum spontaneum L.）生态型对干旱胁迫的差异适应的转录组测序揭示了生态型特异性转录
摘要
背景：野生大麦在其地理分布范围内适应高度多样的环境。对来自对比环境的不同适应野生大麦生态型进行转录组测序有助于鉴定与非生物胁迫耐受和适应有关的基因和遗传变异。
结果：在受控条件下，分析了来自沙漠（B1K2）和地中海（B1K30）两种不同环境野生大麦生态型对干旱胁迫的响应。沙漠生态型在灌溉和干旱条件下损失的水分较多，但相对含水量（RWC）和水分利用效率（WUE）均高于沿海生态型。我们用454平台对两种生态型干旱胁迫下的叶片的标准化cDNA文库进行测序，以鉴定干旱相关转录本。讲阅读量超过50万次的每个生态型从头组装成20439个B1K2假定的*转录本（PUTs），21494个B1K30和28720个联合组装。每个生态型超过 50% 的 PUT 不与其他生态型共享。此外，16%（3245）的B1K2和17%（3674）的B1K30转录本在其他野生大麦生态型和栽培大麦中未显示同源序列命中，并且是生态型特异转录本的备选。每个生态型的800多个*转录本与30多个不同的应激相关基因同源。我们提取了1017个高质量的SNPs来区分这两个生态型。沙漠生态型与栽培大麦之间的遗传距离比地中海生态型与栽培大麦之间的遗传距离高1.9倍。此外，沙漠生态型比地中海生态型具有更大比例的非同义SNP，这表明这些生态型具有不同的来源历史。
结论：结果表明，沙漠和地中海野生大麦生态型之间存在强烈的生理和基因组分化，地中海与栽培大麦的关系更为密切。大量野生大麦*的新转录本被鉴定。沙漠生态型中较高的SNP密度和较大比例的具有功能效应的SNP表明地中海和沙漠野生大麦具有不同的来源历史和自然选择效应。这些数据是改进基因组注释、干旱适应转录组研究的宝贵基因组资源，也是未来大麦改良的新遗传标记来源。
图1.不同土壤含水量下野生生态型大麦生蒸腾作用、叶片RWC和WUE的变化
Barley1K集合中的B1K2和B1K30种质是根据先前的研究选择的，因为它们对干旱的生理反应存在差异。生理测量在温室中进行，植物保持在自然光条件和半控制的温度和湿度下（图 1A-D）。测量的性状包括午间全株蒸腾量 (E)、体重增加，损失，这些都根据植物叶面积、水分利用效率 (WUE) 和叶相对含量 (RWC；参见方法) 进行了标准化。出乎意料的是，在灌溉良好（80% 体积含水量）和干旱条件（30% 体积含水量；图 1E）下，沙漠生态型比地中海生态型品种损失更多的水分。尽管其蒸腾速率较高，但在干旱条件下，沙漠栽培品种比地中海生态型保持更高的 RWC（图 1F）。此外，植物的累积增重与累积蒸腾作用之间的比率（图 1G）表明，沙漠生态型的 WUE 高于地中海生态型，其中 WUE 计算为 RWC 与蒸腾速率 E（单向方差分析，p = 0.02）。为了鉴定反映对干旱胁迫的差异反应的候选基因，在干旱处理的第 5 天对来自每个生态型的两株植物的叶样本进行采样以进行 RNA 提取。
图2. 组装转录本和生态型间同源性概述
使用BLAST将所有PUT相互比较，以确定两个不同的野生大麦生态型之间共享的同源PUT的比例。两种不同的生态型共享来自两种生态型的约 9,546 (29%) 个PUT或46%的B1K2 PUT（图 2C）。 因此，大多数转录本仅限于两种生态型之一。 生态型之间共享转录本的平均长度（B1K2 = 800 bp和B1K30=741 bp）显著大于（p <0.001）生态型特异性转录本（B1K2 = 461 bp 和 B1K30 = 420 bp）。分享比例对于长度超过500和1,000 bp的转录本，PUT分别增加到69%和84%。这表明特定生态型的转录本较短，或者识别其他生态型中直系同源物的能力取决于转录本长度。
图3. B1K基因与大麦基因相关性的对数图
为了评估野生大麦转录组序列在改善栽培大麦基因组注释方面的用途，通过使用 BLASTX预测*转录本覆盖的编码序列（CDS）的范围来调查转录本*或部分覆盖大麦HC基因的数量。62%的B1K PUTs标记了45%的大麦HC基因，5%的与大麦HC基因同源的B1K PUTs*覆盖了HC基因。大多数较短的HC基因（即小于 1500 bp）被PUT很好地覆盖，而较长的HC基因覆盖则较少（图3A和3B）。较长的HC基因比较短的HC基因比例更高，这与野生大麦的产量有关（图3B）。此外，我们使用OrfPredictor来预测CDS。来自所有三个组件的超过 99% 的*转录本包含长度超过33个核苷酸的CDS，平均预测CDS长度为350 bp (B1K)；19%的长度超过500 bp，4%的长度超过1 kb。3.3% (584) 来自 B1K PUT 的预测CDS与它们的直系同源HC CDS具有相同的CDS长度，而2.6%（456）的CDS长度大于其同源体。（图3C）。
