F-box 蛋白是最大的调节蛋白家族之一，在蛋白质降解中起重要作用。在植物中，F 蛋白在功能上非常多样化，只有一小部分被详细表征。本文鉴定了一种新型 F-box 蛋白 FBX92 作为拟南芥叶片生长的抑制剂。AtFBX92 的过度表达导致植物的叶子比野生型小，而AtFBX92水平降低的植物则通过刺激细胞增殖而增加叶片生长。详细的细胞分析表明，AtFBX92 特别影响早期叶片发育过程中的细胞分裂速率。AtFBX92水平降低的植物中几个细胞周期基因表达水平的增加支持了这一点。而玉米同源基因ZmFBX92 在玉米中的过表达对植物生长没有影响，而拟南芥中的异位表达增加了叶子的生长。截断形式的 AtFBX92 的表达表明，ZmFBX92和AtFBX92在拟南芥中功能增益的对比效应是由于ZmFBX92基因中缺少F-box相关结构域。我们的工作揭示了复杂网络中的另一个参与者，它决定了叶子的大小并为识别假定的底物奠定了基础。
ZmFBX92OE和WT植物的表型分析显示，转基因植物的叶面积显著较大，其他表型正常（图1）。在标准和轻度渗透胁迫条件下体外生长的WT和ZmFBX92OE植株的预计花环面积（PRA）在分层后6天至21天（DAS）确定（图1A）。平均而言，胁迫在21 DAS 时使花环面积减少了约 60%。在两种条件下，ZmFBX92OE 植物与WT相比具有显著增加的花环面积（图1A）。ZmFBX92OE 对拟南芥叶片大小的积极影响通过确定22 DAS时的单个叶面积得到证实（图1B、C）。ZmFBX92OE 植物的成熟叶和幼叶都较大。为了检查细胞增殖和/或细胞扩增的差异在多大程度上导致叶片尺寸增加，在WT和ZmFBX92OE叶片中比较了背面表皮细胞的数量和尺寸。ZmFBX92OE 植物中*成熟（22DAS）的第三片叶子由于细胞数量的高度增加（约70%）而增大了约30%，这部分被细胞大小减少约20%（图1D）所补偿。因此，ZmFBX92 在拟南芥中的异位表达导致叶片变大，主要是由于细胞数量增加。
与异位表达ZmFBX92的植物所观察到的相反，与WT植物相比，AtFBX92OE 植物的花环面积减少（图 2A）。这种减少在轻度渗透胁迫下相当。在AtFBX92OE植物中没有观察到其他明显的表型。从6个DAS开始，在发育的早期就已经可以看到减小的花环大小（图 2A）。AtFBX92过表达对叶生长的负面影响通过测定体外生长的 22 天龄植物的单个叶面积得到证实。与WT相比，AtFBX92OE7植物的成熟叶面积显著较小，而对于AtFBX92OE2 植物，所有叶子都显著较小，包括幼叶（图2B、C）。为了探索叶片尺寸减小的细胞基础，在细胞水平上分析了体外生长的 AtFBX92OE 和WT植物的叶片发育。与ZmFBX92OE的情况类似，第三片叶子背面表皮的细胞数量和细胞大小在21 DAS时确定，此时这片叶子*成熟（图2D）。AtFBX92OE2和AtFBX92OE7的成熟第三叶分别比WT小45%和16%，这是由于细胞数量大幅减少，部分补偿通过增加的单元尺寸。
图1.（左图）ZmFBX92表达对拟南芥花环和叶片生长的影响以及叶片大小差异的细胞基础
图2.（右图）在标准体外条件下AtFBX92异位表达对花环和叶片生长的影响以及叶片大小差异的细胞基础
图3.（左图）体外标准条件下AtFBX92 下调对花环和叶片生长的影响以及叶片大小差异的细胞基础
图4.（右图）体外标准条件下AtFBX92del 表达对花环和叶片生长的影响以及叶片大小差异的细胞基础
与过度表达AtFBX92的植物平行，通过使用以下工具设计靶向AtFBX92的人microRNA（amiRNA），产生表达水平降低的转基因植物。对三个表达水平降低的纯合、独立、单基因座系的叶片表型进行了分析，由于它们非常相似，因此仅给出了amiFBX92-4（以下称为amiFBX92）的结果（图3。从DAS的第5天到第21天测定PRA，并显示amiFBX92中的PRA比分析第一天起的WT更大（图3A）。在轻度渗透胁迫下，PRA的增加具有可比性。接下来，在21 DAS测定单个叶面积。除amiFBX92的叶片3外，所有叶片均显著大于WT的叶片（图3B，C）。21 DAS时*成熟的第一对叶的细胞分析表明，叶面积的（24%）是由于细胞数量增加（47%），部分由细胞大小减小（16%）补偿（图3D）。综上所述，我们的数据表明改变AtFBX92表达水平以相反的方式影响叶片大小，这主要是细胞数量差异的结果。
PRA 随时间的定量图像分析，从 6 DAS 到 24 DAS，表明 AtFBX92del 植物比 WT 大（图 4A）。 此外，PRA 增加在发育过程中很早就开始（图 4A），类似于ZmFBX92OE 和 amiFBX92 品系中观察到的效果。与此一致，在 20 DAS 确定的单个叶面积显著大于 WT（图 4B、C）。 一致地，在 20 DAS 时第一对叶的大小增加（27%）是由于细胞数量增加（29%），而对细胞大小没有显著影响（图 4D）。
图5.在标准和干旱胁迫条件下，AtFBX92错误表达对土壤中生长的植物叶片大小的影响
为了验证在体外观察到的AtFBX92表达水平改变的植物花环大小的差异，在自动成像平台 WIWAM 上的土壤中种植了AtFBX92OE、amiFBX92、AtFBX92del和相应的WT植物。分析了每个构建体的两条线。本文也可以证实，在土壤中AtFBX92OE植物比WT小，而amiFBX92和AtFBX92del植物更大，尽管对于AtFBX92del植物这只能在两条线之一中得到证实（图 5A）一般来说，土壤中的影响似乎不如体外显著，因为与WT的绝对百分比差异在体外总是大于在土壤中。通过向培养基中添加甘露醇，在渗透胁迫条件下生长的 AtFBX92OE和amiFBX92植物PRA减少与在这些条件下生长的WT植物的PRA减少没有显著差异。向生长培养基中添加甘露醇通常在实验室环境中用作渗透胁迫的代表。由于土壤种植植物的反应更接近自然条件，还评估了轻度干旱胁迫对AtFBX92水平改变的土壤种植植物和WT植物的影响（图 5B）。
